NiHC：用于基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)的高親和力多鎳 NTA 傳感器芯片

XanTec bioanalytics專門制造與市場上所有主要表面等離子共振 (SPR) 儀器品牌兼容的高質(zhì)量傳感器芯片。通過不斷的研究，XanTec 開發(fā)了當今可用的*泛的傳感器芯片組合，為幾乎所有應(yīng)用提供量身定制的解決方案。

基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (FBDD) 已成為高通量篩選 (HTS) 的替代方案，以改善小分子候選藥物的發(fā)現(xiàn)。篩選低分子量片段可以識別比 HTS 2具有更好效率和生理特征的命中化合物。

SPR 生物傳感器技術(shù)是篩選片段庫3的主要生物物理方法之一，因為盡管許多分析物具有低分子量和低親和力，但較新的儀器可實現(xiàn)足夠高的信噪比以生成可靠的數(shù)據(jù)。

在以前使用 SPR 建立 FBDD 測定的方法中，配體以高固定水平共價固定在傳感器表面上，以確保蛋白質(zhì)穩(wěn)定地結(jié)合到傳感器芯片表面?；蛘撸瑢⑸锼鼗牡鞍踪|(zhì)固定在鏈霉親和素涂層的傳感器表面上，其固有缺點是分析物可能與鏈霉親和素發(fā)生非特異性相互作用。兩種固定方法都無法從傳感器表面去除結(jié)合的配體，這很關(guān)鍵，例如，當使用 GPCR 或其他敏感蛋白質(zhì)時，這些蛋白質(zhì)通常會在長時間的篩選活動中變性。

A)具有固定化His 6-標記融合蛋白的單個NTA基團的剛性羧甲基化葡聚糖水凝膠。

B)柔性HC水凝膠形成聚-NTA螯合“籠"，用于His 6-標記融合蛋白的高親和力固定。

圖 1. NiD（基于葡聚糖）和 NiHC（基于線性聚羧酸鹽的傳感器芯片涂層用于 His 6標記生物分子的可逆固定的比較。

為了使這組敏感分子可用于 FBDD，已經(jīng)進行了各種嘗試以通過基于親和力的 His 6 /鎳-次氮基三乙酸 (NTA) 偶聯(lián)來可逆地固定它們（圖 1）。先進的 NTA 傳感器芯片基于用 NTA 基團修飾的羧甲基葡聚糖 (CMD) 水凝膠。由于 His 6 -標簽和 Ni 2+ -NTA-復合物之間的親和力相對較低，配體從傳感器芯片表面連續(xù)解離會導致不需要的基線漂移。在篩選小分子時，這種漂移效應(yīng)很容易超過特定信號，因此是一個主要問題。

圖 2. 比較NiD 和 NiHC 傳感器芯片上His 6標記融合蛋白 (59.7 kDa; AbCam #ab52213) 的固定能力和穩(wěn)定性的兩個傳感圖的疊加圖。兩種相互作用均基于擴散校正的 1:1 結(jié)合模型進行擬合。NiHC 上的固定顯示了大約。與固定在 NiD 傳感器芯片上的穩(wěn)定性相比，穩(wěn)定性提高了 200 倍。

為了解決這個缺點，XanTec的表面化學家開發(fā)了一種基于強水合且非常柔韌的聚羧酸鹽聚合物骨架的 poly-NTA 傳感器芯片水凝膠涂層。與標準 CMD-NTA 化學相比，這些具有30、200、1000和 1500 nm 厚度的新涂層可以將捕獲的 His 6標記配體的穩(wěn)定性提高 2-3 個數(shù)量級，與最近開發(fā)的 Tris-NTA 4。

圖 3. His 6標記蛋白 A/G 融合蛋白與單 NTA 衍生羧甲基葡聚糖（上）和 XanTec 的聚 NTA 傳感器芯片（下）的相互作用/親和性圖譜。從右上角到左下角增加親和力。親和力圖是使用 EvilFit 5通過結(jié)合/解離速率常數(shù)計算的。

圖 2 和圖 3 顯示了在XanTec 的poly-NTA 表面 NiHC1000M 上捕獲的 His 6標記配體（蛋白質(zhì) A/G 融合蛋白）比在 NTA 衍生的 CMD 水凝膠（單 NTA）上更高的穩(wěn)定性。盡管該表面具有高親和力，但再生條件 (EDTA) 是溫和的，與標準單 NTA 傳感器芯片的條件相同。

Byun 等人的出版物 6 生動地證明了多齒高親和力 Ni-NTA 表面在小分子 SPR 測量中的有效使用。直接結(jié)合試驗用于研究 cGMP (345 Da) 和 cGMP 類似物 (8-NBD-cGMP, 605 Da) 與惡性瘧原蟲( Pf PKG)的 cGMP 依賴性蛋白激酶結(jié)合的動力學，該蛋白激酶與瘧疾相關(guān)寄生蟲。即使在高固定能力下，使用的XanTec bioanalytics高親和力 NiHC NTA 傳感器芯片也沒有顯示出浸出效應(yīng)，因此可以評估遠低于 10 RU 的 R最大值（圖 4）。

圖 4. cGMP 和 8-NBD-cGMP 與 PfPKG 催化結(jié)構(gòu)域（殘基 401-853）結(jié)合的表面等離子共振分析顯示出相似的結(jié)合動力學。通過在 XanTec bioanalytics 高親和力 NiHC NTA 傳感器芯片上捕獲多組氨酸標記的Pf PKG 401–853 并注入 cGMP (345 Da) 稀釋系列 45 s (A)或 8-在 Biacore™ 上進行直接結(jié)合測定NBD-cGMP (605 Da) 70 秒(B)。采用 Langmuir 1:1 模型進行數(shù)據(jù)擬合。

結(jié)論

與 NTA 衍生的羧甲基葡聚糖相比，使用XanTec*的 poly-NTA 傳感器芯片（NiHC 組），可以建立更高的固定化水平，并具有顯著減少浸出的額外好處，從而實現(xiàn)幾乎無漂移的基線。這允許在擴展的 FBDD 活動期間重復固定敏感配體，因為 NiHC 芯片表面在許多相互作用周期中是*可再生的。