trialtusbioscience CL7 / Im7蛋白純化體系說(shuō)明書
CL7 / Im7蛋白純化系統(tǒng)基于兩個(gè)小蛋白（CL7和Im7）之間形成的超高親和力復(fù)合物。CL7（16kDa）是與靶蛋白融合的標(biāo)簽，Im7（10 kDa）是與瓊脂糖樹脂偶聯(lián)的配體。
CL7的野生型是CE7 DNase，一種有毒的細(xì)菌蛋白。突變被設(shè)計(jì)成消除其DNA結(jié)合和DNAse活性，同時(shí)保留了對(duì)Im7的超高親和力。
CL7標(biāo)簽可以在靶蛋白的N或C末端表達(dá)。我們的質(zhì)粒提供了溶解度標(biāo)簽，親和標(biāo)簽和切割位點(diǎn)以及多種克隆選項(xiàng)的組合。
在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，CL7對(duì)溶解度或表達(dá)無(wú)負(fù)面影響。實(shí)際上，CL7改善了在無(wú)標(biāo)簽的大腸桿菌中表達(dá)時(shí)原本不溶的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和溶解度。當(dāng)用CL7標(biāo)簽表達(dá)時(shí)，幾種臨床和治療上相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶部分轉(zhuǎn)移到可溶部分。純化變性表達(dá)的蛋白質(zhì)不需要變性劑或從包涵體重新折疊。
Im7樹脂由CL7的結(jié)合伴侶Im7固定在瓊脂糖樹脂上組成。由于Im7和CL7之間具有高度特異性的親和力，脫靶樹脂的結(jié)合極少。具有35-40 mg / mL的高樹脂結(jié)合能力，可以捕獲大量CL7標(biāo)記的蛋白。Im7結(jié)構(gòu)域具有很高的彈性，使用Gdn-HCl可使樹脂再生并重復(fù)使用多達(dá)100次。
蛋白酶對(duì)于從Im7樹脂柱上洗脫目標(biāo)蛋白至關(guān)重要。
TriAltus純化我們自己的SUMO和PSC蛋白酶，由于它們的超高純度，它們具有很高的活性。TriAltus提供的兩種蛋白酶裂解速度都更快，并且比競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的產(chǎn)品便宜。
例如，如果將60-80 mg的蛋白質(zhì)與5 mL色譜柱結(jié)合，則流速為0.2 mL / min的20 mL洗脫緩沖液中的1 mg蛋白酶將僅在1.5-2小時(shí)內(nèi)洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶是如此稀薄，以至于可能不需要將其去除。但是，如果需要，可以使用用于SUMO的His柱和用于PSC的GST進(jìn)行拋光步驟。
SUMO蛋白酶用于洗脫N末端標(biāo)記的蛋白。它是一種高度特異性的酶，可識(shí)別SUMO切割位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且在切割后不留下氨基酸殘基。它的特異性也使其裂解速度比PSC快。1 ug SUMO可以在30分鐘內(nèi)裂解2 mg底物96％，在40分鐘內(nèi)裂解99％。
PSC蛋白酶用于切割N或C末端標(biāo)記的蛋白。它也是高效的：20 ug PSC將在40分鐘內(nèi)以91％的比例裂解2 mg底物，在60分鐘內(nèi)以99％的比例裂解。
CL7和Im7的鹽獨(dú)立性和高度特異性的結(jié)合親和力使其可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單明了的方案。CL7不是在一步中使用His-trap，而是在隨后使用特殊標(biāo)簽精制蛋白質(zhì)，而是在一個(gè)色譜步驟中實(shí)現(xiàn)了超高純度。
市場(chǎng)上的每種蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)都可以通過(guò)其在兩個(gè)參數(shù)下的性能來(lái)表征：產(chǎn)量和純度。CL7 / Im7系統(tǒng)在兩個(gè)方面都優(yōu)于His-tag和special標(biāo)簽。
TriAltus開發(fā)了一種用于高粘合力樹脂的高效偶聯(lián)方法。Im7樹脂的結(jié)合能力在35-40 mg / mL范圍內(nèi)。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于特殊標(biāo)簽的樹脂，以及在用于His-trap的Ni柱的頂端。
純度取決于蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對(duì)未標(biāo)記的細(xì)胞成分的敏感性。雜質(zhì)分為兩類：基于標(biāo)記的靶蛋白/細(xì)胞組分相互作用的雜質(zhì)，以及由于細(xì)胞組分與色譜柱結(jié)合的配體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。
在高鹽濃度緩沖液的存在下，CL7與Im7的結(jié)合不會(huì)受到干擾。較高的鹽緩沖液可有??效地在純化過(guò)程中盡早去除雜質(zhì)，從而獲得干凈的最終產(chǎn)品。標(biāo)簽對(duì)約0.2-0.3 M的鹽濃度敏感，導(dǎo)致一步層析后純度低。
CL7和Im7彼此高度特定。這樣可以防止標(biāo)簽或配體與細(xì)胞成分（例如DNA和其他蛋白質(zhì)）之間發(fā)生非特異性相互作用。IMAC系統(tǒng)易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結(jié)合。
高耐鹽性和高特異性結(jié)合這兩個(gè)因素的結(jié)合，可產(chǎn)生如此高的純度，以至于CL7 / Im7系統(tǒng)僅需一個(gè)色譜步驟即可。
ttRNAP（Thermus嗜熱菌聚合酶）是一個(gè)大的?400 kDa的蛋白質(zhì)用5個(gè)亞基（α 2 ββ'ω）和4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。傳統(tǒng)上，純化需要5個(gè)連續(xù)的色譜步驟才能獲得足夠高的純度以實(shí)現(xiàn)高活性。蛋白質(zhì)的純度與其活性直接相關(guān)。將細(xì)胞裂解液加載到1.5 M鹽緩沖液中是一步純化的關(guān)鍵。CL7標(biāo)簽附著在最大的 β'亞基上， 不會(huì)干擾亞基組裝。
Cas9是CRISPR技術(shù)的關(guān)鍵組成部分。Cas9活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要4-5個(gè)色譜步驟才能達(dá)到所需的純度。當(dāng)Cas9被CL7標(biāo)記并裝載在1.5 M鹽緩沖液中時(shí)，在一個(gè)純化步驟中可以實(shí)現(xiàn)99％的純度。該酶在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均顯示高活性。
YidC是約32 kDa的細(xì)菌膜整合酶。*，膜蛋白難以純化，因?yàn)榕c細(xì)胞成分發(fā)生疏水性接觸會(huì)造成污染。由于His-tag非特異性結(jié)合至其色譜柱，因此在純化的一個(gè)步驟后會(huì)存在大量雜質(zhì)。CL7對(duì)Im7的特異性將這些影響降至低值，使純度高達(dá)99％。
GCSF，hGH和IFN-α是FDA批準(zhǔn)的三種生物制劑。每個(gè)都有兩個(gè)內(nèi)部半胱氨酸橋，當(dāng)在沒(méi)有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達(dá)時(shí)通常不溶。純化不溶蛋白通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個(gè)色譜步驟。CL7增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的表達(dá)，穩(wěn)定性和折疊性，因此它們不再表達(dá)為包涵體。
